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多聚甲醛固定后，白細胞的免疫表型通常會有所變化。而且，在固定之后，對細胞表面 Marker 的熒光穩定性也會產生很大影響。為了獲得不同表面 Marker 的熒光穩定性，了解固定后細胞的光散射特性和射門以及固定細胞后產生自發熒光是非常必要的。
在固定細胞 0、2、4、6、24、48、96 h 后，用 FITC 標記抗體對全血進行染色測定。通過檢測可溶性熒光素當量分子 (MESF) 來定量分析熒光強度。結果顯示出，固定作用 48 h 后，細胞大小（FSC）和細胞顆粒度 (SSC) 能夠引起顯著的下降，在單核細胞中，固定作用 96 h 后，自發熒光急劇增加，是固定前的 9 倍。
從自發熒光的來看：未染色的樣本在固定之后上機檢測顯示，熒光強度相比固定之前有所增強，自發熒光被糾正后，固定前樣本間沒有明顯的區。在細胞固定后，淋巴細胞、單核細胞、粒細胞的自發熒光持續增加，96 h 達到zui高點。判斷熒光標記的穩定性之前要先進行自發熒光的校正。
大體上來講，細胞固定后 48 h，細胞大小（FSC）發生明顯降低，但到了 96 h 后則基本保持不變。在淋巴細胞、單核細胞、粒細胞均發生同樣的變化。同樣的，SSC 在某種程度上也出現降低的特點。
文獻中 Denny 稱：在固定 1、24 h、48 h 后，通過檢測熒光強度說明抗體與細胞結合能力是發生了一些變化。在固定 24 h 后，CD3、CD19 有明顯增加，而 CD4、CD8、CD16 則沒有明顯改變。在固定 48 h 后，CD3、CD4、CD19 急劇增加，使用固定后洗滌的方式，不同的表面抗原也有不同的改變，CD4、CD8、CD19 是穩定的，沒有發生顯著變化，而 CD3 的熒光強度卻發生降低。
兩種可能引起熒光強度衰退的原因：
1.NaN3；經試驗驗證，樣本固定在 1%PFA 的 PBS（不含 NaN3）中，標記抗體的熒光強度并未發生顯著的變化。
2. 固定的時間；經試驗驗證，在固定 30 min 后，用 PBS（含 NaN3）重懸細胞后，自發熒光增加較為平緩。而在進行自發熒光校準之后，標記抗體的熒光強度沒有影響。 隨著固定時間的延長，粒細胞的大小（FSC）和顆粒度 (SSC) 都有明顯的降低。而淋巴細胞和單核細胞都被粒細胞覆蓋上，對射門來講都是非常困難的。
參考文獻： Changes in Fluorescence Intensity of Selected Leukocyte Surface Markers Following Fixation； Judith C.Stewart；Michelle L.Villasmil ；Mark W.Frampton 等。
13916499749
